Изучение защитных эффектов вироцидных препаратов на модели коронавирусной пневмонии

Патологии респираторной системы, вызванные вирусом ИБК у кур, имеют много общих черт с патологией респираторной системы вызванной SARS CoV2 у человека.

Миронова Т.Е., Афонюшкин В.Н.

Резюме. 

 

 

Инфекционный бронхит кур (ИБК) – широко распространенное в Российской Федерации заболевание, вызываемое вирусом из рода Gammacoronavirus. Патологии респираторной системы, вызванные вирусом ИБК у кур, имеют много общих черт с патологией респираторной системы вызванной SARS CoV2 у человека. Было проведено испытание эффективности вироцидных препаратов «Экоцид С», «Тривирон», «Арговит» на цыплятах, зараженных десятикратной дозой вакцины на основе аттенуированного штамма H120 против инфекционного бронхита кур (IBV). В эксперименте наблюдали наличие воспалительных изменений в кишечнике, легких и тимусе, на 6 день после заражения. Экспериментальные группы характеризовались менее выраженными воспалительными изменениями и меньшей удельной долей проб тимуса и легких содержащих геномную РНК IBV. Так как вироцидная активность Тривирона, Экоцида С, Арговита была возможно только в кишечнике, то в качестве модели респираторной инфекции COVID19 данные экспериментов косвенно подтверждают гипотезу о принципиальной возможности преимущественного накопления коронавирусов в кишечнике и последующем поражении легких при гематогенном перераспределении вирусных частиц и антигенов как IBV, так и других коронавирусов, включая SARS CoV2.

 

 

 

Введение

 

Патологии респираторной системы, вызванные вирусом инфекционного бронхита (ИБК) у кур [1, 11]., имеют много общих черт с патологией респираторной системы вызванной SARS CoV2 у человека. В обоих случаях есть основания считать, что после локальной инфекции непосредственно по месту заражения, происходит накопление инфекционного агента в кишечнике (органе, обладающем наибольшим секреторным потенциалом клеток, рецепторами и ферментными системами пригодными для репродукции коронавируса и созревания вирусных частиц). Оба вируса являются низкокопийными и значительная часть повреждений наносится за счет реакции иммунной системы. Низкая концентрация коронавирусов в организме также создает перспективы для эффективной противовирусной терапии нацеленной на дальнейшее снижение копиности вирусных частиц в органах с наибольшей активностью его репродукции [1].

 

Препрараты с вироцидной активностью в тонком отделе кишечника потенциально могут быть эффективны. Клинические наблюдения показывают эффективность препаратов типа «Экоцид С», «Тривирон», «Арговит» (наночастицы серебра производства НПЦ «Вектор-Вита») при вирусной мальадсорбции на птицефабриках (флавивирусной, астровирусной этиологии). Противовирусный препарат Тривирон начали применять в ветеринарии сравнительно недавно [6,7]. По механизму действия он не имеет аналогов и относится к новой фармакологической группе синтетических рибонуклеаз [2, 3]. Арговит, содержащий наночастицы серебра, до недавнего времени рассматривали в контексте антибактериальной активности, ввиду большей методической сложности оценки противовирусных эффектов. Тем, не менее, сравнительно недавно были выявлены противовирусные эффекты наночастиц серебра и других металлов [14, 8, 18, 19, 10, 11, 23, 13]. 

Недавно была показана активность наночастиц и против SARS Cov2 [24]. Экоцид С (представляет собой порошок пероксомоносульфата (тройная соль)) (50%) поверхностное активное вещество (додецилбензолсульфонат натрия) органические кислоты и неорганические буферные системы. Достаточно широко это средство применяется в отечественном птицеводстве путем выпаивания живой птице (преимущественно при вирусной мальадсорбции). Высокая антибактериальная и, противовирусная активность в сочетании с малой токсичностью и стабильностью в живом организме делают его перспективным в том числе в качестве противовирусного средства местного применения [4] и дезинфектанта препятствующего горизонтальному переносу генов антибиотикоустойчивости [5].

 

Цель исследования – провести скрининг веществ с вироцидной активностью на организменной модели коронавирусной инфекции

 

Материалы и методы

 

Петушки кросса шавер в возрасте 14 суток, получили вакцину против ИБК (Вакцина против инфекционного бронхита кур из штамма H120 живая сухая). Вакцину вводили перорально, индивидуально в дозе 5 lg ЭИД 40 на голову. Были сформированы опытные группы по 10 голов и контрольная группа 14 голов.

 

Дозировки препаратов были следующие: «Арговит С 1%» (наносеребро в концентрации 10мг/мл). Производитель НПЦ «Вектор-Вита». Расход на голову в сутки – 5 мкг серебра. Выпаивали 250 мкл 2 раза в сутки. Тривирон (0,03%) выпаивали индивидуально– по 285 мкл на голову, двухкратно (утром и вечером). Препарат №3 (моноглицерид лауриловой кислоты) – доза введения составила 0,1мг на голову.   Экоцид С 0,05% птица пила самостоятельно. Курс выпаивания всех препаратов был 5 суток. Производили убой на 6 сутки.

 

Из внутренних органов выделяли РНК, делали ОТ ПЦР. РНК выделяли с использованием силика-колонок, с предварительным разрушением клеток гуанидин-изотиоционатом. Копийность вируса ИБК оценивали методом ОТ ПЦР [6].

 

Результаты исследований и обсуждение

 

При вскрытии отмечали наличие характерных изменений в тимусе (вирус ИБК поражает мозговую зону тимуса), пневмонии. Наибольшая интенсивность и экстенсивность поражений – в группах, получавших препарат №3 (моноглицерид лауриловой кислоты) и контрольной группе. Легкие были гиперемированные, отечные. Иногда очаги изменений имели треугольную и ромбовидную форму что указывало на гематогенный занос инфекционного агента. Тонкий отдел кишечника гиперемирован. Толстый отдел кишечника без изменений. Почки не воспалены. В опытных группах (в большинстве случаев) изменения в кишечнике, легких тимусе менее выражены или отсутствовали (рисунки №№1, 2).

 

 

 

Как следует из рисунка 5 вирус ИБК обнаруживается в тимусе.  Наибольшее его количество в пробах от цыплят контрольной группы и цыплят, получавших препарат №3 (с12 моноглицерид, моноглицерид лауриловой кислоты). Все остальные препараты в той или иной мере предотвратили попадание вируса в тимус, даже через сутки после последнего их применения (рисунок 2, 5).

 

Так как почти все препараты не всасываются (кроме препарата №3) то единственной причиной отсутствия их в тимусе было блокирование попадания вируса в кровеносную систему. Подавить накопление вируса в тимусе после попадания вирусных частиц в этот орган, испытываемые препараты заведомо не могли.

 

Как следует из рисунка 3 – наилучшим протективным действием обладал «Экоцид С», только одна проба тимуса была положительна при использовании Тривирона и три положительных пробы были при использовании препарата «Арговит» (наночастиц серебра).

 

 

Экоцид С, Тривирон и Арговит обладают прямым повреждающим эффектом в отношении вирусных частиц т.е. имеют общий механизм действия и сходны по фарамкокинетическим свойствам. Эффект в отношении защиты от вируса IBV также был сходен. Мы наблюдали протективный эффект в части проявления признаков пневмонии и поражений тимуса выражающийся в снижении выраженности воспалительных изменении или полном отсутствии воспаления легких и тимуса в экспериментальных группах, получающих Экоцид С, Тривирон и Арговит.

 

Штамм H120 является пневмотропным вирусом. Тем не менее, по данным ОТ- ПЦР, концентрация вируса ИБК в трахее меньше чем в бронхах [6], а в кишечнике вирус детектируется чаще и дольше, чем в респираторной системе.  Если учесть, что вся кровь из кишечника неминуемо проходит через малый круг кровообращения, то вполне можно допустить преимущественно гематогенный занос вирусных частиц в респираторную систему с ее последующим повреждением.  

 

 

 

Как видно из рисунков №№ 4 и 5, копийность РНК вируса ИБК относительно копийности гена домашнего хозяйства GAPDH в кишечнике может быть больше в 25-40 тыс. раз, чем в тимусе, таким образом, вклад кишечной популяции вируса в концентрацию вируса в других внутренних органах может быть более значимым, чем самостоятельное размножение данного вируса в этих органах.  Однотипные эффекты от использования препаратов, инактивирующих вирусные частицы в просвете кишечника, также могут быть возможны только при условии главенствующей роли образования и созревания коронавирусов в кишечнике, в патогенезе поражения респираторной системы.  Внелегочные формы СOVID19 описаны в научной литературе [17], поражение кишечника часто фиксируется практически при всех коронавирусных инфекциях включая (FIP, TGS, IBV, COVID19 [20, 25] и т.д.). Помимо исключительно большого потенциала для репликации вируса для коронавирусов большое значение имеет протеолитическое созревание S-белка и последующая интернализация вируса в клетку, после связывания с клеточным рецептором.  В этом процессе активно участвуют сериновые протеазы, включая трипсин как у SARS CoV2[12, 15,16, 26] так и у IBV [21]. В этом контексте наночастицы серебра, потенциально могут оказывать дополнительный эффект в качестве ингибитора сериновых протеаз [9]. В научной литературе описан эффект от ингибиторов сериновых протеаз в части подавления попадания коронавирусов в клетку [16].

 

Инфекционный бронхит как модель кишечных коронавирусных инфекций животных и человека, с осложнениями в виде ОРДС, более перспективна, чем тесты in vitro. Относительно низкая копийность коронавирусов и, следовательно, большое значение в реализации патологических процессов, процессов перераспределения вирусных частиц из зон с высокой концентрацией в органы, где наличие вируса может вызвать жизнеугрожающее состояние, делает клеточные модели малоэффективными.

 

Заключение

 

 

1. Вироцидные препараты «Экоцид С», «Тривирон», «Арговит», не обладающие системным действием, обеспечивают подавление коронавирусной инфекции как в части снижения интенсивности поражения респираторной системы, кишечника и тимуса, так и в части снижения инфицированности птицы вирусом ИБК.
2. В качестве модели респираторной инфекции COVID19 данные экспериментов коссвенно подтверждают гипотезу о принципиальной возможности преимущественного накопления коронавирусов в кишечнике и последующем поражении легких при гематогенном перераспределении вирусных частиц и антигенов SARS CoV2
3. Динамическое равновесие между воспроизводством коронавирусов в кишечнике и их элиминацией должно легко нарушаться при снижении концентрации функционально активных вирусных частиц (под действием вироцидных средств)
4. В плане фармакопрофилактики инфекционного бронхита, представляется перспективным применение вироцидных средств в период, предшествующий формированию поставкцинального иммунитета.

 

 

Работа выполнена при частичной поддержке проектов ПФНИ ГАН на 2017-2020 гг. (VI.55.1.1, 0309-2016- 0002) «Биология бактериально-вирусных сообществ». Проекта РФФИ 20-04-60355 «Разработка мультимасштабной иммуно-эпидемиологической математической модели COVID-19 c учетом воздействия на экономику регионов и сценариев действия органов власти»

 

Литература

 

1. Афонюшкин, В.Н. Возможный патогенез коронавирусных инфекций на примере ИБК в качестве модели инфекции, ассоциированной с COVID-19 у людей / В.Н. Афонюшкин // БИО. – 2020. – №4. – С.4-6.

 

2.Афонюшкин, В.Н. Оценка роли флавивирусной инфекции в снижении продуктивности цыплят-бройлеров в РФ 2011 – 2013 гг / В.Н. Афонюшкин, Е.И. Рябчикова, В.Н. Сильников // Ветеринария. –  2014; 8; С. 15 – 19.

 

3.Афонюшкин, В.Н. Альтернативный способ профилактики и лечения РРСС / В.Н. Афонюшкиин, А.В. Литвинов // Свиноводство. –  2017. – №1. – С.56 – 58.

 

4.Афонюшкин, В.Н. Изучение противофаговой активности дезинфектантов в качестве фактора подавления горизонтальной передачи генов / В.Н. Афонюшкин, В.С. Черепушкина, О.П. Татарчук, О. А. Фролова // Вестник КрасГАУ. – 2020. – № 4 (157). – С. 88-96.

 

5. Афонюшкин, В.Н. Влияние дезинфицирующих средств на основе персульфата калия, перекиси водорода, глутаральдегида и четвертичных аммонийных соединений на генетический материал бактериальных патогенов, специфичных для мясоперерабатывающей промышленности / В.Н. Афонюшкин, К.А. Табанюхов, В.С. Черепушкина, Ю.С. Хоменко, О.П. Татарчук // Теория и практика переработки мяса. – 2016. Т. 1. – № 1. – С. 54-61.

 

6. Афонюшкин, В.Н. Изучение противовирусного действия препарата тривирон на возбудителя инфекционного бронхита кур / В.Н. Афонюшкин, А.Н. Ширшова, Д.В. Шамовская, Д.Н. Пломодьялов, Ю.Н. Козлова // Ветеринария. – 2018. – №7. – С. 24-28.

 

7.Burakova, E. Structure–activity relationships in new polycationic molecules based on two 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octanes as artificial ribonucleases / E. Burakova, N. Kovalev, M. Zenkova et al.  // Bioorganic Chemistry.–   2014.– №57.– P.127 – 131.

 

8. Baram-Pinto, D. Inhibition of herpes simplex virus type 1 infection by silver nanoparticles capped with mercaptoethane sulfonate / D. Baram-Pinto, S. Shukla, N. Perkas, A. Gedanken, R. Sarid // Bioconjug. Chem.– 2009.– №20.– P.1497–1502. doi: 10.1021/bc900215b;

 

9.Baram-Pinto, D. Inhibition of HSV-1 attachment, entry, and cell-to-cell spread by functionalized multivalent gold nanoparticles / D. Baram-Pinto, S. Shukla, A. Gedanken, R. Sarid // Small.– 2010.– №6.– P.1044–1050. doi: 10.1002/smll.200902384;

 

10. Alex Chin, Julie Chu, Mahen Perera, Kenrie Hui, Hui-Ling Yen, Michael Chan, Malik Peiris, Leo Poon. Stability of SARS-Co 2  in different environmental conditions. The Lancet Microbe: Medical journal. - Гонконгский университет: Elsevier, 2020. – 2 April (vol.20, iss.4) – ISSN 2666-5247

 

11. Cavanagh D. Coronaviruses in poultry and other birds. Avian Pathol.–2005.–  №34.– P.439 – 448.

12. J.L.Chambers G.G.Christoph M.Krieger L.Kay R.M.Stroud  Silver ion inhibition of serine proteases: Crystallographic study of silver-trypsin Biochemical and Biophysical Research Communications.–1974.–№59(1).– P.70-74

13. Cristina Balagna, Sergio Perero, Elena Percivalle, Edoardo Vecchio Nepita, Monica Ferraris Virucidal effect against coronavirus SARS-CoV-2 of a silver nanocluster/silica composite sputtered coating//Open Ceramics.– 2020.– №1

 

14. Elechiguerra J.L., Burt J.L., Morones J.R., Camacho-Bragado A., Gao X., Lara H.H., Yacaman M.J. Interaction of silver nanoparticles with HIV-1. J. Nanobiotechnol.– 2005.– №29.– P.3–6.

 

15. Graham Simmons , Dhaval N Gosalia, Andrew J Rennekamp, Jacqueline D Reeves, Scott L Diamond, Paul Bates Inhibitors of cathepsin L prevent severe acute respiratory syndrome coronavirus entry Proc Natl Acad Sci USA.–2005 Aug 16;102(33):11876-81 DOI: 10.1073/pnas.0505577102

 

16. M. Kawase, K. Shirato, L. van der Hoek, F. Taguchi, S. Matsuyama, Simultaneous treatment of human bronchial epithelial cells with serine and cysteine protease inhibitors prevents severe acute respiratory syndrome coronavirus entry. J Virol 86, 6537-6545 (2012)

 

17. V. G. Puelles et al., Multiorgan and Renal Tropism of SARS-CoV-2. N Engl J Med, 2020

 

18. Lara H.H., Ayala-Nuñez N.V., Ixtepan-Turrent L., Rodriguez-Padilla C. Mode of antiviral action of silver nanoparticles against HIV-1. J. Nanobiotechnol.–2010.– №8.– P.1–10. doi: 10.1186/1477-3155-8-1. 

 

19. Lara H.H., Ixtepan-Turrent L., Garza-Treviño E.N., Rodriguez-Padilla C. PVP-coated silver nanoparticles block the transmission of cell-free and cell-associated HIV-1 in human cervical culture. J. Nanobiotechnol.–2010.– №8.–P.15–25. doi: 10.1186/1477-3155-8-15.;

 

20. Lucio B., Fabricant J. Tissue tropism of three cloacal isolates and Massachusetts strain of infectious bronchitis virus. Avian Dis.–1990.– №34.–P.865 – 870.

 

21. M. S. Mahmood, M. Siddique, I. Hussain and A. Khan Trypsin-induced hemagglutination assay for the detection of infectious bronchitis virus // Pakistan Vet. J.–2004.–№24(2).– P.54

 

22. Rogers J.V., Parkinson C.V., Choi Y.W., Speshock J.L., Hussain S.M. A preliminary assessment of silver nanoparticles inhibition of monkeypox virus plaque formation. Nanoscale Res. Lett.– 2008.–№3.– P.129–133. doi: 10.1007/s11671-008-9128-2;

 

23. Sun L., Singh A.K., Vig K., Pillai S., Shreekumar R., Singh S.R. Silver nanoparticles inhibit replication of respiratory sincitial virus. J. Biomed. Biotechnol.– 2008.– №4.– P.149–158;

 

24. J. Santos et al., Repurposing Therapeutics for Potential Treatment of SARS-CoV-2: A   Review. Viruses 12, (2020).

 

25. Xiao, F. et al. Evidence for gastrointestinal infection of SARS-CoV-2. Gastroenterology 158, 1831–1833.e3 (2020).

 

Xia, S., Lan, Q., Su, S., Wang, X., Xu, W., Liu, Z., Zhu, Y., Wang, Q., Lu, L., & Jiang, S. (2020). The role of furin cleavage site in SARS-CoV-2 spike protein-mediated membrane fusion in the presence or absence of trypsin. Signal Transduction and Targeted Therapy, 5(1);

 

УДК: 615.03:615.076.9:578.76: 578.83:578.423

 

Изучение защитных эффектов вироцидных препаратов на модели коронавирусной пневмонии

 

Миронова Т.Е. ^1,2, младший научный сотрудник, аспирант

 

2-го года обучения

 

Афонюшкин В.Н. ^1,3, кандидат биологических наук, заведующий сектором
Козлова Ю.Н. ¹, кандидат биологических наук, младший научный сотрудник

 

Бобикова А.С. ², аспирант 1-го года обучения

 

Коптев В.Ю. ¹, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник

 

Черепушкина В.С. ¹, младший научный сотрудник,

 

Сигарева Н.А. ², кандидат биологических наук, старший преподаватель

 

Колпаков Ф.А. ⁴, кандидат биологических наук, заведующий лабораторией биоинформатики

 

 

 

¹ Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Сибирский федеральный центр агробиотехнологий РАН
² Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Новосибирский государственный аграрный университет

 

³ Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

 

⁴ Федеральный исследовательский центр информационных и вычислительных технологий

 

 

Поделиться статьей в социальных сетях: