Люминисцентная микроскопия слизистой оболочки двенадцатиперстной и тощих кишок цыплят бройлеров после вакцинации против эймериоза.

Эймериоз сельскохозяйственных птиц стал проблемой для птицеводства в первой половине XX столетия – с момента перевода отрасли на промышленную основу, когда были созданы благоприятные условия для быстрого накопления возбудителей в окружающей среде и массового интенсивного перезаражения птицы. В рамках изучения последствий совместного действия вакцин против эймериоза в одном организме в связи с существующим риском восстановления патогенности вакцинных штаммов эймерий при использовании разных вакцин в условиях одного хозяйства исследовано влияние на слизистую оболочку кишечника цыплят-бройлеров вакцин против эймериоза «Эймериавакс 4М» и препарата сравнения «Вакцина 1», и сочетанной вакцинации смесью этих вакцин («Вакцина 1» + «Эймериавакс 4М»). 

Сравнительные испытания применения этих вакцин показали лучшую протективность слизистой оболочки двенадцатиперстной и тощих кишок цыплят при использовании вакцины «Эймериавакс 4М»: длина ворсин в среднем статистически значимо составляла в двенадцатиперстной кишке 1514,46±91,87 мкм, что на 19,91 % больше (Р=0,01), чем в контрольной группе. В тощей кишке длина ворсин в среднем – 904,03±63,64 мкм, что на 32,19 % больше (Р=0,01), чем в контрольной группе, и на 45,06 % больше (Р=0,04), чем в группе, иммунизированной «Вакцина 1». 

Превышение длины ворсин в двенадцатиперстных и тощих кишках цыплят-бройлеров во всех опытных группах по сравнению с контрольной (интактной) группой свидетельствует об отсутствии неблагоприятно влияния вакцин на состояние слизистой оболочки кишечника цыплят. Комбинация вакцин «Вакцина 1» + «Эймериавакс 4М» не приводила к изменению длины ворсин кишечника в меньшую сторону, что косвенно свидетельствует об отсутствии повышения патогенности при смешивании этих вакцин в среднесрочной перспективе, за счет эффектов комплементации генов патогенности. 

Люминисцентная микроскопия слизистой оболочки  после вакцинации против  эймериоза.

Фролова Ольга Анатольевна, аспирант кафедры анатомии, патологической анатомии и хирургии.
Афонюшкин Василий Николаевич, к. б. н., зав. сектором молекулярной биологии

Введение 

Эймериоз (кокцидиоз) – протозойное заболевание, вызываемое простейшими рода Eimeria отряда Coccidia, встречается повсеместно, чаще в весенне-летний периоды, в теплых помещениях возможно зимой, и протекает остро, подостро, хронически. Птицы болеют с 10-дневного возраста и старше. Заболевание стало проблемой для птицеводства в первой половине XX столетия – с момента перевода отрасли на промышленную основу, когда были созданы благоприятные условия для быстрого накопления возбудителей в окружающей среде и массового интенсивного перезаражения птицы [6]. 

M. W. S. Walston et al. [10] выявили, что у птиц, больных эймериозом, отмечается атрофия микроворсинок эпителия кишечника. Ворсинки – это места поглощения питательных веществ из просвета кишечника, поэтому любое повреждение приводит к потере поглощения и использования питательных веществ у бройлеров. Freitas et al. и Р. Р. Гиззатуллин [9, 2] у больных кокцидиозом кур в тонком отделе кишечника обнаружили подострый десквамативный катаральный энтеритс разрушением микроструктуры кишечной стенки, в сохранившихся, но деформированных кишечных ворсинках – обескровленную капиллярную сеть, большинство кишечных крипт утратили регенерационный потенциал. Во многих участках кишечной стенки отмечали разрушение не только ворсинок, но и всего эпителиального монослоя крипт. 

Исходя из этого целью наших исследований является изучение с помощью люминесцентной микроскопии влияния вакцинации против эймериоза разными вакцинами на микроархитектонику ворсинок и крипт слизистой оболочки двенадцатиперстной и тощих кишок цыплят-бройлеров. 

Задачи исследования: изучить длину ворсин и глубину крипт двенадцатиперстной и тощих кишок цыплят, вакцинированных против эймериоза вакцинами «Эймериавакс 4М», препаратом сравнения «Вакцина 1», а также смесью этих вакцин. 

Новизна исследования состоит в изучении действия сочетанной иммунизации живыми аттенуированными вакцинами против эймериоза на морфологию ворсин и крипт слизистой оболочки тонкого кишечника бройлеров. 

В связи с тем, что существует риск восстановления патогенности вакцинных штаммов эймерий при использовании разных вакцин в условиях одного хозяйства и факт передачи генов патогенности при половом размножении эймерий не опровергнут с использованием методов полногеномного секвенирования [7], то изучение последствий совместного действия вакцин против эймериоза в одном организме является актуальным. 

Материалы и методы 

Объектом исследования являлись цыплята-бройлеры кросса Росс-308. Основным методом исследования слизистой оболочки двенадцатиперстной и тощих кишок выбран широкий и перспективный по своим возможностям метод люминесцентного спектрального анализа. 

Для эксперимента было сформировано по принципу аналогов 4 группы цыплят: 1 группа – интактный контроль (n=15), 2 группа – опытная (n=10) вакцинирована вакциной «Вакцина 1» 1 доза/гол; 3 группа – опытная (n=10) – вакциной «Эймериавакс 4М» (EimeriaPtyLimited, Австралия) 1 доза/гол; 4 группа – опытная (n=10) – смесью вакцин «Вакцина 1» 0,5 дозы/гол. и «Эймериавакс 4М» 0,5 дозы/гол. 

Цыплята опытных групп иммунизированы вакцинами per os в возрасте 14 дней. В возрасте 35 дней цыплят декапитировали, обескровливали и проводили отбор образцов поперечных фрагментов кишечника, которые фиксировали в 10 %-ном растворе нейтрального формалина. Для исследования части кишечника вынимали из формалина, вырезали фрагменты, помещали в лунки 24-луночного микропланшета, заливали дистиллированной водой, добавляли краситель пропидия йодид (PI) из расчета 5 мкл на 100 мкл дистиллированной воды. Время окрашивания 60 мин. Кишечные ворсины и крипты визуально были хорошо различимы благодаря четкой окраске клеток. Микрофотографии слизистой оболочки кишечника представлены на рис. 5, 6. 

Люминесцентную микроскопию проводили с помощью микроскопа Imager D1 (Zeiss) при увеличении 40х и 100х (Zeiss), Ex/Em 546/575-–640 нм (светоделитель 560 нм). Микрофотографирование слизистой оболочки проводили с помощью видеокамеры AxioCam MRm (Zeiss), совмещенной с компьютером посредством кабеля USB и программы Axio Vision (Zeiss, Германия). 

Статистическую обработку полученных в ходе экспериментальных исследований данных, проводили с помощью пакета анализа программы Microsoft Office Excel [4]. Статистическую значимость различий выявляли с помощью методов вариационной и непараметрической статистики, с определением средних величин и их простых ошибок (M±m), t-критерия Стьюдента [5]. Различия считали статистически значимыми, если вероятность случайности не превышала 5 % (Р

Результаты исследований 

Результаты измерения длины ворсин и глубины крипт слизистой оболочки двенадцатиперстных и тощих кишок цыплят контрольной и опытных групп представлены в таблице 1.

В нашем эксперименте длина кишечных ворсин в контрольной группе в среднем составляла в двенадцатиперстной кишке 1262,95±53,74 мкм, минимальная 1038,98 мкм, максимальная 1567,40 мкм; в тощей – 6 83,88±40,37 мкм; минимальная 532,19 мкм, максимальная 802,19 мкм. Глубина крипт двенадцатиперстной кишки – 245,06±14,65 мкм, тощей – 167,38±17,57 мкм. Графическое изображение длины ворсин и глубины крипт слизистой оболочки кишечника цыплят в контрольной и опытных группах изображено на Рис. 1–4. 

Во 2 опытной группе, где применялся препарат сравнения «Вакцина 1», длина ворсин в среднем составляла в двенадцатиперстной кишке 1424,49±55,71 мкм, что на 12,79 % больше (Р=0,05), чем в контрольной группе, минимальная 1203,13 мкм, максимальная 1580,26 мкм. Глубина крипт в двенадцатиперстной кишке – 272,74±31,21 мкм, что на 11,29 % больше (Р>0,05), чем в контрольной группе. В тощей кишке длина ворсин в среднем – 623,22±91,64 мкм, что на 8,87 % меньше (Р>0,05), чем в контрольной группе, минимальная 306,26 мкм, максимальная 865,30 мкм. Глубина крипт – 206,99±18,62 мкм, что на 23,66 % больше (Р>0,05), чем в контрольной группе. 

В 3 опытной группе, где использовалась вакцина «Эймериавакс 4М», длина ворсин в среднем составляла в двенадцатиперстной кишке 1514,46±91,87 мкм, что на 19,91 % больше (Р=0,01), чем в контрольной группе, и на 6,32 % больше (Р>0,05), чем в группе, вакцинированной «Вакцина 1»; минимальная 1300,49 мкм, максимальная 1812,65 мкм. Глубина крипт двенадцатиперстной кишки 277,10±43,56 мкм, что на 13,07 % больше (Р>0,05), чем в контрольной группе и на 1,60 % больше (Р>0,05), чем во 2-й опытной группе. В тощей кишке длина ворсин в среднем 904,03±63,64 мкм, что на 32,19 % больше (Р=0,01), чем в контрольной группе, и на 45,06 % больше (Р=0,04), чем в группе, иммунизированной «Вакцина 1»; минимальная 825,98 мкм, максимальная 1057,03 мкм. Глубина крипт – 213,76±21,89 мкм, что на 27,71 % больше (Р>0,05), чем в контрольной группе и на 3,27 % больше (Р>0,05), чем во 2-й группе. 

В 4-й опытной группе, где иммунизировали цыплят сочетанием вакцин «Вакцина 1» и «Эймериавакс 4М», длина ворсин в среднем составляла в двенадцатиперстной кишке 1597,11±120,77 мкм, что на 26,46 % больше (Р=0,01), чем в контрольной группе, минимальная 1341,03 мкм, максимальная 1817,96 мкм. Глубина крипт – 283,55±79,31 мкм, что на 15,71 % больше (Р>0,05), чем в контрольной группе. В тощей кишке длина ворсин в среднем – 878,40±87,51 мкм, что на 28,44 % больше (Р=0,04), чем в контрольной группе, минимальная 204,47 мкм, максимальная 362,62 мкм. Глубина крипт – 188,86±18,72 мкм, что на 12,83 % больше (Р>0,05), чем в контрольной группе. 

Об суждение результатов 

П. В. Хатеева с соавторами [8] в своих исследованиях установили, что в норме длина кишечных ворсин тощей кишки у цыплят может варьировать от 523 мкм до 1154 мкм, с изменчивостью данного признака от 84 мкм до 531 мкм. Исходя из этого, полученные нами данные длины ворсин тощих кишок говорят об отсутствии нарушений структуры слизистой оболочки кишечника цыплятбройлеров на фоне применения вакцин против эймериоза. 

Изменение длины кишечных ворсин возможно при метаболическом синдроме. А.С. Бобикова [1] с соавторами в опыте с мышами выяснили, что длина кишечных ворсин слизистой оболочки тонкого кишечника у мышей с метаболическим синдромом статистически значимо на 35 % больше, чем у животных контрольной группы. Длина ворсин увеличивалась в связи с увеличением диаметра кишок. 

Так как эймерии поражают эпителий ворсинок кишечника, В. Ю. Коптев и др. [3] выяснили, что при применении биотинилированного производного окисленного декстрана (БОД) средняя длина кишечных ворсин тощей кишки цыплят достоверно больше на 37,7 % по сравнению с контролем. По мнению авторов укорачивание ворсин слизистой оболочки кишечника при эймериозе является защитной реакцией на развитие воспалительного процесса в кишечнике, для уменьшения площади поверхности всасывания. 

В 1 дозе вакцины «Эймериавакс 4М» содержится: 30 ооцист E. acervulina, 80 – E. maxima, 100 – E. necatrix, 120 – E. tenella. Вакцинные ооцисты заселяют эпителиальные клетки слизистой оболочки и оказывают протективное действие в определенном отделе кишечника цыплят: E. acervulina – двенадцатиперстную кишку, E. maxima – тощую и частично может быть в двенадцатиперстной кишках. Превышение длины ворсин в двенадцатиперстных и тощих кишках цыплят бройлеров во всех опытных группах по сравнению с контрольной (интактной) группой свидетельствует об отсутствии неблагоприятного влияния вакцин на состояние слизистой оболочки кишечника цыплят. 

Заключение 

Сравнительные испытания применения вакцины «Эймериавакс 4М» и препарата сравнения «Вакцина 1» показали лучшую протективность слизистой оболочки двенадцатиперстной и тощих кишок цыплят при использовании вакцины «Эймериавакс 4М»: длина ворсин в среднем статистически значимо составляла в двенадцатиперстной кишке 1514,46±91,87 мкм, что на 19,91 % больше (Р=0,01), чем в контрольной группе. В тощей кишке длина ворсин в среднем 904,03±63,64 мкм, что на 32,19 % больше (Р=0,01), чем в контрольной группе, и на 45,06 % больше (Р=0,04), чем в группе, иммунизированной «Вакцина 1». 

Комбинация вакцин «Вакцина 1» и «Эймериавакс 4М» не приводила к изменению длины ворсин в меньшую сторону, что косвенно свидетельствует об отсутствии повышения патогенности при смешивании этих вакцин в среднесрочной перспективе, за счет эффектов комплементации генов патогенности.

Список литературы 

 

1. Бобикова А. С. Особенности структуры кишечных ворсин у мышей с метаболическим синдромом / А. С. Бобикова, Д. С. Болдырева, В. Н. Афонюшкин [и др.] // Сибирский вестник с.-х. науки. 2017. Т. 47. № 3. С. 62–67.
2. Гиззатуллин Р. Р. Клинико-морфологическая оценка эффективности соединения «Дегельм-14» при эймериозе кур: дисс. … канд. вет. наук. 03.02.11, 06.02.01. Казань, 2013. 196 с
3. Коптев В. Ю. Эффективность биотинилированного производного окисленного декстрана при экспериментальном эймериозе кур / В. Ю. Коптев, В. Н. Афонюшкин, Н. В. Давыдова [и др.] // Птицеводство. 2021. № 2. С. 50–53. 
4. Лебедько Е. Я. Биометрия в MS Excel: Учебное пособие / Е. Я. Лебедько, А. М. Хохлов, Д. И. Барановский [и др.] // СПб.: Издательство «Лань», 2018.
5. Медицинская статистика. T-критерий Стьюдента онлайн [Электронный ресурс]. / URL: medstatistic.ru/calculators/averagestudent.html (дата обращения: 09.10.2021).
6. Мишин B. C. Интегрированная система контроля кокцидиоза / B. C. Мишин, В. М. Разбицкий, Н. П. Крылова [и др.] // Птицеводство. 2004. № 8. С. 17–21.
7. Фролова О. А. Биохимические изменения в плазме крови цыплят при сочетанной иммунизации аттенуированными вакцинами против эймериоза // Международный вестник ветеринарии. 2021. № 3. С. 39–45. DOI: 10.17238/issn2072- 2419.2021.3.39. 
8. Хатеева П. В. Анализ причин возникновения синдрома мальабсорбции цыплят-бройлеров на основе исследования особенностей слизистой тонкого отдела кишечника методом люминесцентной микроскопии / П. В. Хатеева, В. Н. Афонюшкин, Н. А. Сигарева // Материалы VI Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы сельского хозяйства горных территорий». 2017. С. 279–282. 
9. Freitas F. L. Da C. Clinical and pathological aspects in broilers (Gallus gallus domesticus) infected experimentally with Eimeria acervulina / F. L. Da C. Freitas, K. De S. Almeida, A. A. Do Nascimento [et al.] // Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 2008. V. 17. №. 1. P. 16–20.
10. Walston M. W. S. Effect of infection with mixed Eimeria species on T cells and T regulatory cell properties / M. W. S. Walston, R. Shanmugasundaram, R. K. Selvaraj // J. Appl. Poult. Res. 2016. 25. P. 407–413.

 

Поделиться статьей в социальных сетях: